غربالگری اختلالات متابولیک به کمک طیف سنجی جرمی

ظهور طیف سنجی جرمی متوالی (MS/MS) (Tandem mass spectrometry) تعداد بیماری هایی را که می توان با سرعت و دقت بالا شناسایی کرد، ساده ساخته است. به کمک تکنیک MS/MS می توان تا 55 ناهنجاری بیوشیمیایی را شناسایی کرد. غربالگری نوزادان در بهبود پیش آگهی بسیاری از اختلالات متابولیک مفید و مؤثر شناخته شده است. با این وجود هنوز در طیف بیماری های مورد نظر برای غربالگری اختلاف نظر وجود دارد که ناشی از عدم وجود آمار کافی در این زمینه است.

در حال حاضر در کشورهای پیشرفته، بیست و نه بیماری که بیست و دو تای آن ها بیماری های متابولیک ارثی هستند در برنامه غربالگری نوزادان گنجانده شده اند. بیست و دو بیماری متابولیک دیگر نیز بر پایه ای این غربالگری اولیه قابل تشخیص هستند. بیماری های دیگری نظیر بیماری های ذخیره لیزوزومی نیز کاندید اضافه شدن به لیست بیماری های غربالگری هستند. غربالگری نوزادان در سال های 1960 و با ابداع تست Guthrie آغاز شد. تا سال ها، فنیل کتونوری و هیپوتیروئیدیسم مادرزادی و چند بیماری محدود دیگر، تنها بیماری هایی بودند که در برنامه غربالگری گنجانده شده بودند.

از حدود سال 2000 و با استفاده از تکنیک MS/MS باور عمومی "یک تست-یک آنزیم-یک بیماری" که اساس تست گاتری بود به طور کامل متحول شد. در تکنیک MS/MS به کمک دو طیف سنج جرمی متوالی با سرعت بالا و مقدار کم نمونه می توان تعداد زیادی از اختلالات بیوشیمیایی شناسایی کرد. پس از آن بود که برنامه های غربالگری در مقیاس وسیع در آمریکا، استرالیا و عربستان آغاز شد.

در حال حاضر در کشورهای مختلف از 30 بیماری تا 5 بیماری برای غربالگری نوزادان مد نظر قرار داده شده است. مزایای غربالگری گسترده ی نوزادان این است از ریسک بیماری های تشخیص داده نشده یا دیر تشخیص داده شده اجتناب شده و از بسیاری از موارد مرگ یا معلولیت شدید ممانعت به عمل می آورد. در بسیاری از موارد بیماری هایی که از طریق غربالگری تشخیص داده می شوند به سادگی و با مداخله های تغذیه ای قابل درمان و کنترل هستند. باور عموم متخصصین بر این است که غربالگری، پیش آگهی بسیاری از بیماری ها نظیر گلوتاریک اسیدوری تیپ I، تیروزینمی تیپ I و II ، آرژنینوسوکسینیک اسیدوری و نقایص اکسیداسیون اسید چرب را بهبود می بخشد.

مهمترین پیشرفت در انجام آزمایشات غربالگری ، ظهور طیف سنجی جرمی MS/MS به عنوان ابزاری در تشخیص بیماری های متابولیک ارثی است که امروزه در جهان به طور گسترده مورد استفاده قرار می گیرد. بیماری هایی که از این روش شناسایی می شوند عبارتند از نقایص متابولیکی نظیر آمینواسیدوپاتی ها، ارگانیک اسیدمی ها، و اختلالات اکسیداسیون اسیدهای چرب. امروزه از قابلیت بالای MS/MS می توان برای تشخیص اختلالات کربوهیدرات ها نظیر گالاکتوزمی و بیماری های ذخیره لیزوزومی نیز بهره برد.

برخلاف روش های رایج غربالگری، MS/MS یک آنالیت واحد را اندازه نمی گیرد (یک تست-یک بیماری)؛ بلکه پروفایل متابولیت ها را شناسایی و تعیین مقدار می کند. ارزیابی یک نمونه لکه خون خشک توسط MS/MS می تواند در مورد 60 اسید آمینه، اسیل کارنیتین ها و نسبت میان آن ها اطلاعات کافی جهت تشخیص حدود 40 بیماری متابولیک به دست دهد. البته تفسیر این اطلاعات بسیار پیچیده و سخت می باشد.

نقص متابولیسم اسیدهای آمینه و اسیل کارنیتین ها منجر به تغییر غلظت این مولکول ها می شود. برخی بیماری های متابولیک پروفایل ساده و مشخصی دارند؛ مانند سطح بالای فنیل آلانین و نسبت فنیل آلانین به تیروزین در فنیل کتونوری. ولی بیشتر بیماری های متابولیک تفاوت های آشکاری نشان می دهند. به عنوان مثال تغییر سطح پروپیونیل کارنیتین (C3) می تواند به پروپیونیک اسیدمی، متیل مالونیک اسیدمی، کمبود مالتیپل کربوکسیلاز، و کمبود ویتامین B12 در مادر نسبت داده شود. در مورد 3-هیدروکسی ایزووالریل کارنیتین (C5OH)، هفت ارگانیک اسیدمی مختلف برای تشخیص افتراقی باید مد نظر قرار گیرند که عبارتند از کمبود 3-متیل کروتونیل CoA کربوکسیلاز، کمبود 3-هیدروکسی 3-متیل گلوتاریل CoA لیاز، کمبود مالتیپل کربوکسیلاز، کمبود 3-متیل گلوتاکونیل CoA هیدراتاز، کمبود بیوتینیداز، کمبود 2-متیل3-هیدروکسی بوتیریل CoA دهیدروژناز و کمبود بتا-کتوتیولاز.

بیومارکرها مولکول هایی هستند که در مایعات بدن موجود بوده و اندازه گیری آن ها می تواند برای بررسی فرایندهای بیولوژیکی نرمال، وضعیت بیماری یا پاسخ به درمان مورد استفاده قرار بگیرد. در این چارچوب، مارکرهای اولیه در غربالگری نوزادان، متابولیت هایی هستند که مربوط به یک مسیر بیوشیمیایی تغییر یافته (کاهش یا افزایش یافته) در یک بیماری خاص هستند و از نظر تشخیصی ارزش دارند. در حالیکه بیومارکرهای ثانویه، بیومارکرهایی هستند که نشان دهنده ی افزایش ریسک یک بیماری متابولیک هستند که در این مورد می توان به نسبت میان آنالیت ها اشاره کرد. رتبه بندی بیومارکرها، تفسیر پروفایل این متابولیت ها را تسهیل کرده و حساسیت تست ها را افزایش می دهد. به عنوان مثال در تیروزینمی کبدی-کلیوی (تیپ I)، افزایش سوکسینیل استون بیومارکر اولیه محسوب می شود، در حالیکه تیروزین بیومارکر ثانویه است زیرا غلظت آن ممکن است افزایش یافته یا طبیعی باشد. علاوه بر این همیشه افزایش تیروزین نشانه ی این بیماری نیست. تیروزین در نوزادان نارس یا نوزادانی که با وزن پایین متولد می شوند و عملکرد کبد در آن ها هنوز به طور کامل شکل نگرفته نیز افزایش می یابد. استفاده از نسبت آنالیت ها برای تفسیر صحیح پروفایل متابولیت ها ضروری است. استفاده از این نسبت ها میزان نتایج مثبت کاذب را به میزان کمتر از 01/0% کاهش داده و کارآیی آزمایشات غربالگری را بهبود می بخشد. از آنجایی که نتیجه مثبت کاذب استرس زیادی برای خانواده ها ایجاد می کند، تشخیص دقیق بیماری از اهمیت ویژه ای برخوردار است. تفسیر نتایج حاصل از غربالگری باید توسط متخصص خبره که تسلط کافی بر بیوشیمی واکنش های متابولیسم و بیماری های متابولیک دارد انجام شود و موفقیت این آنالیز ها بیشتر از همه به مهارت آنالیز کننده بستگی دارد.

فاز آنالیتیکال برنامه غربالگری با پردازش نمونه های لکه خون و تزریق آن ها به دستگاه MS/MS برای به دست آوردن پروفایل اسیدهای آمینه و اسیل کارنیتین ها آغاز می شود. چنانچه یک نتیجه ی غیر طبیعی به دست بیاید، نمونه اولیه باید مجدداً ارزیابی شود. اگر نتیجه ی غیر طبیعی تکرار شود، یک نمونه ی دیگر باید درخواست شود. معمولاً نظر بر این است که نتیجه تست غربالگری در عرض 24 ساعت و تست تأییدی در عرض 48 ساعت و قبل از اینکه هرگونه علامتی در بیمار ظاهر گردد انجام شود.

در مطالعه ای که اخیراً منتشر شده است، Cutoff اسیدهای آمینه و اسیل کارنیتین ها با استفاده از نتایج حاصل از آزمایش 25 میلیون کودک و مقایسه نتایج حاصل از جمعیت نرمال با بیش از ده هزار مورد مثبت حقیقی انجام شد. علیرغم ارزش آماری بالا، این نتایج فقط برای 7 روز اول زندگی معتبر بود. در مجموع به نظر می رسد که مقادیر cutoff برای هر متابولیت و نسبت آن ، میان جمعیت های مختلف و محدوده ی سنی متفاوت متغیر هستند و به همین دلیل هر آزمایشگاه باید مقادیر cutoff خود را تعیین کرده و به طور منظم ارزیابی نماید. کنترل کیفی نیز در این آزمایشگاه ها باید به طور دوره ای و منظم انجام شود.

نتایج به دست آمده از تست های غربالگری باید در زمینه بالینی تفسیر گردد. سن بارداری، وزن تولد، سن به روز،و بیماری های همراه، عواملی هستند که باید مد نظر قرار گیرند. تغییرات غیر اختصاصی پروفایل متابولیت ها معمولاً در نوزادان نارس و نوزادانی که با وزن کم متولد می شوند به دلیل نارس بودن عملکرد کبد و کلیه دیده می شود. بیشترین تغییراتی که در این نوزادان دیده می شود، بالا رفتن تیروزین و متیونین در پروفایل اسیدهای آمینه است. افزایش آرژینین و اسیدهای آمینه شاخه دار نیز در این گروه از بیماران دیده می شود که معمولاً به دلیل متکی بودن گلوکونئوژنز و کتوژنز به متابولیسم این ترکیبات است. در نوزادان نارس و نوزادان با وزن پایین، گوتامات نیز ممکن است کاهش نشان دهد.

وجود فاکتورهای ریسک نظیر رابطه خویشاوندی میان والدین و وجود خواهر یا برادر مبتلا، نیازمند توجه ویژه ای به آزمایشات است.

وضعیت تغذیه نیز در تفسیر نتایج حاصل از تست های غربالگری اهمیت به سزایی دارد. >*نوع تغذیه

مصرف مقادیر زیاد پروتئین در شیر به افزایش اسیدهای آمینه به خصوص متیونین و تیروزین منجر می شود. تجویز شیر خشک های غنی از پروتئین یا شیر گاو می تواند سطح بعضی از اسیدهای آمینه مانند فنیل آلانین یا تیروزین را افزایش دهد. اگر چنین مسائلی در تفسیر تست ها در نظر گرفته نشود، ممکن است نتایج مثبت کاذب حاصل شود. بعضی از اسیل کارنیتین ها در نوزادانی که با شیرخشک حاوی مقادیر بالای اسیدهای چرب زنجیره متوسط تغذیه می شوند، افزایش می یابند.

گرسنگی بیش از چهار تا شش ساعت باعث افزایش گلوکونئوژنز از اسیدهای آمینه ی عضلات می شود. در نتیجه، بیشتر اسیدهای آمینه در گرسنگی طولانی کاهش می یابند؛ به جز اسیدهای آمینه شاخه دار که ممکن است افزایش یابند.

کارنیتین یک مشتق اسید آمینه است که برای انتقال اسیدهای چرب از سیتوزول به داخل میتوکندری و متعاقباً تجزیه ی اسیدهای آمینه به استیل کوآنزیم A طی بتا-اکسیداسیون و در نهایت تولید انرژی مورد نیاز هستند. یک مولکول اسید چرب با یک مولکول کارنیتین واکنش داده و یک مولکول اسیل کارنیتین ایجاد می کند که طول زنجیره اسیل کارنیتین به تعداد کربن های اسید چرب بستگی دارد. متابولیسم بسیاری از اسیدهای آمینه نیز با تولید ارگانیک اسیدهای واسطه ای همراه است که به کوآنزیم A کونژوگه شده و بنابراین می توانند با کارنیتین استریفیه شوند. کاهش سطح کارنیتین آزاد در دو حالت ممکن است رخ دهد: >>* بچه هایی که از مادران مبتلا به کمبود کارنیتین متولد می شوند. >>* کاهش کارنیتین ثانویه به اختلال متابولیک

هر دوی این حالات باعث می شوند سطح کارنیتین برای کونژوگاسیون ریشه های اسیل کافی نباشد. در چنین حالاتی در صورت وجود ارگانیک اسیدمی یا نقایص اکسیداسیون اسیدهای چرب، افزایش بیومارکرها کمتر بوده و احتمال دریافت نتایج منفی کاذب می باشد. در چنین مواردی و در صورت پایین بودن سطح کارنیتین خون، باید بعد از تجویز کارنیتین به میزان mg/Kg 100 آزمایشات مجدداً تکرار شوند. در مقابل، در بچه هایی که تحت درمان با کارنیتین هستند، کارنیتین بالا نباید به اختلالات متابولیک نسبت داده شود.

پروفایل غیر طبیعی متابولیت ها همیشه نشان دهنده اختلال متابولیک نیست. در بچه های بستری که تحت درمان با آنتی بیوتیک هستند و گلوکز داخل وریدی و تغذیه تزریقی دریافت می کنند، معمولاً اسیدهای آمینه شاخه دار، متیونین، و آرژنین بالارفته و گلوتامات کاهش می یابد. با توجه به حساسیت بالای تکنیک MS/MS می توان حاملین و هتروزیگوت های اختلالات متابولیک و مادران حامل را از طریق بالا بودن مارکرهای اولیه شناسایی کرد. حتی کمبود ویتامین در مادر را می توان با آزمایش نمونه خون نوزاد شناسایی نمود. پروفایل متابولیک نوزادانی که از مادران مبتلا به کمبود ریبوفلاوین متولد می شوند الگوی تغییر یافته ای مشابه گلوتاریک اسیدوری تیپ I نشان می دهد.

تست های تکمیلی در زمینه بیماری های متابولیک ارثی عبارتند از آنالیز ارگانیک اسیدها در ادرار و آنالیز اسیدهای آمینه و آنالیز اسیدهای آمینه و اسیل کارنیتین ها در پلاسما یا سرم. وقتی که بیماری متابولیک هیچ پروفایل اختصاصی مشخصی ندارد، تشخیص قطعی با تعیین فعالیت آنزیم یا تعیین نقص ژنتیکی انجام می شود. به عنوان مثال نقص آنزیم CPT-I با تغییر در پروفایل اسیل کارنیتین همراه است ولی تغییری در الگوی ارگانیک اسیدها نشان نمی دهد.

معمولاً بهتر است در نتیجه ی آزمایشات غربالگری تست های تکمیلی مناسب و آزمایشگاه هایی که قابلیت انجام تست ها را دارند معرفی و اطلاعات مربوط به نحوه نمونه گیری جهت این تست ها ضمیمه شود.

در جداولی که در فایل ضمیمه آورده شده اند در گروه های بیماری های اسیدهای آمینه، ارگانیک اسیدمی ها و اختلالات اسیدهای چرب، بیومارکرهای اولیه و ثانویه مرتبط با بیماری و تست های لازم برای تأیید تشخیص آن ها خلاصه گردیده اند.